Nació en Quito. Educado en la Escuela de Bellas Artes de su ciudad natal, recogió la herencia del muralismo mexicano, especialmente en su vertiente indigenista. A la edad de 20 años participó en el Salón de Mayo. Tres años después, en reconocimiento a su arte, le fue otorgado el premio Mariano Aguilera .
Por invitación del Departamento de Estado, en 1943, visitó Estados Unidos y expuso en Nueva York, ciudad en la que otros artistas hispanoamericanos, David Alfaro Siqueiros y Diego Rivera en especial, habían abierto brecha en el esfuerzo por dar forma pictórica a temas histórico sociales dramáticos. Sensible a otras corrientes del arte contemporáneo, Guayasamín evolucionó paulatinamente hacia una figuración de relativo origen expresionista , sin abandonar sus temas predilectos: la miseria y la opresión del indio ecuatoriano, dentro de un paisaje de significación trágica. Destacan en este periodo sus Niños muertos , donde tanto el dibujo como la pintura crispan y dramatizan los personajes y las cosas representadas. El mundo occidental y el precolombino, la tradición pictórica hispánica (Goya, el Greco y Picasso sobre todo) se perfilan como antecedentes de su universo personal, en algunas ocasiones sometido a efectismos melodramáticos.
A partir de 1962 se opera en su obra un cambio sustancial; el pintor se despoja de elementos superfluos y sobriamente pinta manos, rostros desesperados y mutilados, en blanco y negro, en dimensiones mayores a las de sus cuadros precedentes (algunos alcanzan los cuatro metros cuadrados); sus obras recuerdan el dramático mundo fragmentado del Guernica de Picasso. Como homenaje a su ciudad natal realizó una serie que contiene paisajes, no paisajismo estilista. Falleció en Quito. Su biógrafo concluye: "De hito en hito, controvertida y no siempre aceptada del todo, su pintura responde al espíritu americano".