El mismo rey dio pábulo a la sospecha de su ilegitimidad cuando declaró (desconociendo el derecho de Juana) heredero al trono a uno de sus hermanos, y cuando éste murió, a su hermana la futura Isabel "la Católica". Aunque posteriormente varió tal posición y reconoció a Juana como hija legítima y sucesora , era ya muy tarde y la mayoría de la nobleza se negó a ver en ella a la continuadora de la monarquía.
Ante esta situación, Enrique IV pretendió asegurarle una corona, y quiso unirla en matrimonio con la familia reinante en Portugal; el enlace no se concretó, por lo que, en 1470 la casó con el duque de Guyenne (hermano de Luis XI de Francia). Mas en 1474, cuando murió Enrique IV y se presentó el problema de la sucesión, "la Beltraneja" se vio abandonada por muchos de sus antiguos partidarios, quienes prefirieron jurar lealtad a doña Isabel "la Católica".
A instancias del gran maestre de Calatrava y de otros nobles, Alfonso V de Portugal se comprometió a casarse con Juana y a defender los derechos de ella al trono español. Con tal fin creó un ejército y lo envió a luchar contra los Reyes Católicos. Pero sus soldados fueron derrotados en Toro, en 1476, y en Albuera en 1479, por lo que renunció a mantener la guerra y a unirse a Juana en matrimonio. Para zanjar la situación, los Reyes Católicos propusieron casarla con su primogénito ; mas Juana rechazó el ofrecimiento comprendiendo que el príncipe, cuando alcanzara la mayoría de edad, podría renegar de lo pactado por sus padres; dignamente se retiró al convento de Santa Clara en Coimbra, Portugal, donde pasó el resto de sus días y fue muy querida por todos. Los portugueses no utilizaron el infamante apodo, sino que la llamaron "la excelente señora" . Cuando murió Isabel "la Católica", su viudo, el rey Fernando, quiso casarse con Juana, pero ella no lo aceptó. Según las crónicas, Juana poseía belleza , simpatía, cultura y bondad extraordinarias, y, "aunque la vida se ensañó con ella, era digna de la mejor de las fortunas".