Cuando regresó a Inglaterra empleó sus encantos en seducir al rey Enrique que, cansado de su esposa legítima, la princesa española Catalina de Aragón, la tomó como concubina mientras trataba de conseguir de la Iglesia la anulación de su matrimonio. Durante las negociaciones pertinentes, Enrique VIII puso cada vez más de relieve sus relaciones con Ana, hasta que, al quedar ésta encinta en 1533, la tomó en matrimonio y rompió con Roma. Así se inició el Cisma de Inglaterra, consolidado al declararse el rey, por medio de la llamada Acta de Supremacía , "cabeza de la Iglesia Anglicana".
En adelante, Enrique, con toda facilidad, hizo cuanto le dio la gana, sin respeto para ninguna de las instituciones establecidas: declaró nulo su matrimonio con Catalina y válido el celebrado con Ana; ilegítima a María (hija de Catalina) y legítima su descendencia con Ana, de acuerdo al Acta de Sucesión que dictó.
Ana fue solemnemente coronada como reina de Inglaterra en la abadía de Westminster. No obstante, solo tres meses después, Enrique ya daba muestras de encontrarse hastiado de ella, y tomó por concubina a una de las damas de su corte, Juana Seymour. La situación se hizo aún más difícil para la reina cuando dio a luz a una niña, en vez del hijo varón que deseaba Enrique para asegurar la sucesión directa en la casa Tudor.
El rey acusó a su esposa de adúltera en 1536. El propio padre de Ana y su tío, el duque de Norfolk, formaron parte del tribunal que la declaró culpable. Sus alegados cinco amantes fueron ejecutados seguidamente, acusados de alta traición, y la propia Ana, que había sido encerrada en la Torre de Londres, fue decapitada el 19 de mayo de 1536. Ese mismo día, Enrique obtuvo del eclesiástico Cranmer, licencia para unirse en matrimonio con Juana Seymour.
Se cuenta que hasta el último momento de su vida, Ana se preocupó por su apariencia, por lucir hermosa; subió al cadalso ataviada como su fuese a asistir a una fiesta. Se dice también que, en los momentos en que rodaba la cabeza de Ana, Enrique se hallaba disfrutando con sus amigos en una cacería.
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